" Сушествует ряд локализаций рака, которые практически не лечатся. Например, когда
метастазы проникают в печень, и в таких случаях даже химиотерапия не помогает. И только в редких случаях метастазы удается удалить хирургическим путем. Но мы знали, что пероксидаза хрена повышает иммунитет организма, а это главное условие при лечении. Эту самую пероксидазу даже научились получать в чистом виде. Но это оказалось, безумной затеей - из тонны сырья выходило 5 граммов! Когда-то я вычитал в трехтомнике «Иммунология», изданном в СССР еше в 1974 году, что попадание пероксидазы хрена в кровь увеличивает эффективность лечения в 4 тысячи раз! Но только через много лет додумался, как его ввести, - через клизму!
Вот как это делается
Натереть хрен на самой мелкой терке. Взять 1 ст. ложку хрена и залить половиной стакана кипяченой воды. Оставить в холодильнике на 12 часов. Взять детскую клизму и после стула ввести граммов 30-40. Но вначале сделать очистительную клизму.
Таким образом настойка всасывается мгновенно и сразу попадает в печень. На поверхности лейкоцитов у онкологических больных есть рецепторы, воспринимаюшие пероксидазу хрена, и вот тогда активация лейкоцитов-киллеров увеличивается в четыре тысячи раз.
Через 10-15 процедур на контрольном сканировании метастазы рака не фиксировались или купировались. Клизму с хреном делать через день.
Сложнее лечение рака легких с помошью пероксидазы хрена. Самый лучший способ - ингаляция, но она будет эффективна, если хрен измельчить до 3-5 микрон, все, что крупнее, организмом не усваивается.
В институте биоприборостроения разработаны особые ингаляторы-спинхиллеры, способные измельчить хрен и подготовить сотню ингаляций. Разработан, но не выпускается, поскольку в этом случае хрен становится лекарственным препаратом! А это семь лет испытаний, годы утверждений и т.д.
Но дышать фармкомитет не запрещает, трите и дышите, уже в самом процессе натирания вы достаточно надышитесь, а потом, накрывшись полотенцем, подышите над изготовленным лекарственным продуктом. Процедура займет 2-3 минуты. А спинхиллеров, может, и я дождусь - мне ведь всего 72!
Итак, вы натираете корни хрена и дышите 1-2 минуты, пока из глаз не потекут слезы. Делать это следует ежедневно, до полного выздоровления.
Как-то нам в редакцию позвонила читательница, страдавшая хронической пневмонией. Ей 58 лет, вылечилась таким способом менее чем за месяц.
"- Леонид Николаевич Ж. из ФРГ, у него метастазы в печени. А этот орган практически не лечится, однако опыты с микроклизмами из хрена показывали положительные результаты. Леонид Николаевич пробовал, но ощутил сильное жжение и не может жидкость достаточно долго удерживать. Что ему можно посоветовать?
- Очевидно, человек сделал слишком сильную концентрацию. При том, что клизма не должна превышать 30 граммов - ее не нужно удерживать, а жидкость сама там останется. Перед процедурой, если у вас не было стула, следует сделать очистительную клизму. Всего следует провести 10- 15 сеансов через день, а по завершении показаться врачу...
Вот звонок из Германии, из города Эссена. У Леонида Журавского (я о нем уже упоминал, когда мы писали о клизмах с настоем хрена, были у него некоторые проблемы с их применением) тяжелое заболевание, печень уже поражена метастазами. Понятно, в таких случаях говоришь предельно осторожно, ведь можно ожидать чего угодно. И вдруг слышу: «Рост метастазов остановился, будете говорить или увидите доктора Ласкина, передайте ему мою искреннюю благодарность. А вам спасибо за ваши публикации».
X
....«Я вернулась из отпуска и узнала, что Нине отказали в лечении. Нашла журналы «ФиС» со статьями доктора Ласкина, и мы начали применять его методы лечения настойками хрена и гречкой. Проблема заключалась в том, что Нина уже практически ничего не ела и не могла даже пить. Ее мучили постоянные тошнота и рвота, даже после приема воды. Первая клизмочка из хрена вызвала жжение, а последующие были безболезненны, всего сделали уже 10 процедур. Нина начала понемногу есть и гречневую кашу с добавлением небольшого количества оливкового масла. Вчера она выпила два сырых яйца. Первое яйцо (это было в обед) организм принял нормально, и Нина сказала: «Мне так стало хорошо!»,....
Обращаюсь к вам за помощью. Мы хотели бы получить консультацию доктора Ласкина и других специалистов, причем в кратчайшие сроки, так как счет идет не на месяцы, каждый день дорог.
Можно ли делать клизмочки с хреном более 15 раз?
....Мы связались с соавтором диеты Александром Балюрой. Кстати, он сейчас вплотную занят тем, чтобы упростить использование целебных свойств хрена, а точнее - пероксидазы, в нем содержащейся, она активирует макрофаги, разрушающие раковые клетки. Так вот, Балюра экспериментирует с заточением хрена в запаянную пробирку, где сохранится и жидкость, и дух, если можно так выразиться. Ведь в таких мегаполисах, как Москва, к примеру, найти корень хрена - проблема, если нет за городом участка, а если и есть, то он там редко у кого произрастает, а бабулек, торговавших у метро, городские власти давно ликвидировали.
Вот что говорит А. Балюра: «В такой тяжелой ситуации, как с подругой автора письма, можно продолжать делать клизмы из настойки хрена и дальше. Можно уменьшить количество жидкости до 5 мл (это всего-навсего столовая ложка раствора). При условии грамотной подготовки: мелкая терка, разведение холодной кипяченой водой, отстаивание в холодильнике в течение 10-12 часов».
X
Но вот женщина из Донецкой области беспокоится о своем отце. Они живут в разных городах Украины, и дочь дает советы отцу и его семье, видимо, по телефону. У отца поражены желудок и печень, но после питания гречкой и микроклизм из настоянного хрена печень уменьшилась до нормального размера. Но оказалось, что процесс переместился еще и в легкое, и теперь он регулярно дышит парами натертого хрена.
X
Несколько вопросов «технологического характера». Читатель М. из Тулы спрашивает, почему хрен для введения через клизму надо настаивать и держать в холодильнике 12 часов? Есть ли минимум и максимум? Объясняем: 10-12 часов - это время доказано лабораторным путем. Натереть нужно всего 1 ст. ложку хрена, но не делать впрок, каждый раз он должен быть свежего изготовления.
Один из читателей сетует, что после 12 часов настойка становится слишком холодной, и спрашивает, нельзя ли ее разбавить теплой водичкой? Отвечаем: нельзя, какая же это будет концентрация? Просто подержите после холодильника настойку некоторое время при комнатной температуре, и она станет приемлемой для применения.
Еще о хрене. Пока известно, что он хорошо влияет на печень, даже когда она поражена метастазами. В других случаях Ласкин использовать клизмы не рекомендует.
А вот дышать натираемым хреном можно и нужно при заболевании не только легких, но и бронхов, горла, носа, то есть всей области носоглотки. Для этого достаточно проводить процедуру два раза в день по 2-3 минуты, пока из глаз не потекут слезы. Напомню, что таким способом можно ликвидировать и менее тяжелые недуги - грипп, простуду, насморк."
Отвечая на первое письмо, могу сказать следующее. Клизмы из хрена - это, как показала практика, самый эффективный способ проникновения целебных веществ в печень, чтобы справиться с метастазами. Делать клизмы надо следующим образом: 1 ст. ложку натертого хрена залить 0,5 стакана охлажденной кипяченой воды, и все это поставить на 8-12 часов в холодильник (но не в морозилку). Затем настой процедить и приблизительно 20 мл набрать в клизму (маленькую, детскую) для введения в организм. Кашицу хрена ни в коем случае нельзя вводить в прямую кишку, так как она слишком концентрированная, и это может привести к ожогу слизистой.
Остаток процеженного настоя можно хранить еще одни сутки в холодильнике, чтобы на следующий день из него сделать еще одну клизму. Вводить такие клизмы следует после опорожнения кишечника. Делать клизмы можно ежедневно, но через день готовить новый настой из хрена, чтобы в полной мере воспользоваться его антираковыми свойствами.
Надеюсь, что мои ответы помогут авторам писем справиться с болезнью. Нас очень волнуют результаты лечения. В любом случае напишите о них в редкцию.
С пожеланиями выздоровления,
Александр БАЛЮРА, кандидат медицинских наук
Свёклу 1 кг на 5 литров воды кипятить 5-6 часов на тихом огне, получится густой отвар, растворяет камни ж/п способ проверил на себе удачи.
В № 8 «АиФ-Здоровье» за 2008 год я прочитала, что, по данным Канадской ассоциации врачей и Международного агентства по изучению рака, мощные противораковые вещества содержат многие растительные продукты. Это капуста (кочанная, цветная, брокколи, брюссельская), чеснок, лук (репчатый и шалот), шпинат, кресс-салат, семена льна, льняное масло, помидоры, черный перец, куркума, черника, малина, ежевика, голубика, клюква, виноград, темный шоколад, цитрусовые, зеленый чай, красное вино). Ежедневный прием этих продуктов может защитить от рака даже в случае плохой наследственности. В связи с этим у меня два вопроса. Если все так просто, то почему во всех странах люди не едят ежедневно эти продукты, чтобы защитить себя от рака? Почему в этот список не включены гречневая каша и оливковое масло, составляющие основу антираковой диеты доктора Ласкина?
Марина Л., Москва
Не только гречка
Диетологический метод профилактики и терапии рака в последние годы быстро развивается. Ряд специалистов, работающих в рамках этого направления, даже считают рак «болезнью недостаточности», то есть болезнью, возникающей от недостаточного потребления особых фитохимикатов, входящих в состав зеленого чая, красного вина, бурого риса, ягод, фруктов, овощей, грибов, орехов, семян, специй. Организм человека тысячелетиями адаптировался именно к такому питанию, и переход в XX веке к питанию рафинированными углеводами (белый хлеб, белый сахар, сладости, кондитерские изделия) трагически сказался на его здоровье. Одной из главных болезней цивилизации стал рак. Возвращение к рациону питания, основанному на натуральных продуктах, позволяет организму человека эффективно противостоять онкологическим заболеваниям.
В последнее время разработан целый ряд антираковых диет. В западных странах особое внимание, если говорить о продуктах, уделяется клюкве, а о диетах - средиземноморской (овощи, фрукты, продукты из цельного зерна, морская рыба, оливковое масло, сухое красное вино).
Так, недавно в США было проведено исследование действия средиземноморской диеты на способность тормозить развитие рака у 23 пациентов 43-74 лет, отказавшихся от радикального лечения, с подтвержденным на биопсии ограниченным раком простаты. В среднем через 38,5 месяца наблюдения у 87% мужчин отметили 58-процентное снижение уровня ПСА (простат специфического антигена), который был маркером активности рака. А у 3 мужчин, участвующих в этом исследовании, отмечено очень небольшое увеличение ПСА. Эти результаты свидетельствуют о значительной эффективности средиземноморской диеты в снижении прогрессии рака простаты.
Итак, сочетание в питании ряда натуральных продуктов позволяет организму контролировать, предупреждать и даже останавливать раковый процесс. Почему же люди регулярно едят не эти удивительно полезные продукты, а предпочитают вредные для здоровья сладости, выпечку и пр.? Да потому, что они гораздо вкуснее и к тому же, как алкоголь, вызывают к себе пристрастие. Это самая настоящая пищевая зависимость, и она сродни наркотической. Когда там еще рак возникнет, а разная вкуснятина прямо сейчас улучшит настроение, снимет стресс и депрессию, вернет душевное спокойствие. Попробуй, откажись! Пока гром не грянет, мужик не перекрестится. Так и живем, так и болеем, так и умираем гораздо раньше положенного срока.
Теперь по поводу второго вопроса: почему в список антираковых продуктов не включены гречневая каша и оливковое масло? Дело в том, что гречневую кашу широко употребляют в основном в России, Украине, Белоруссии. В США, Канаде, Западной Европе ее едят преимущественно эмигранты, а гречку там выращивают не для еды, а для того, чтобы извлекать из нее витамины, минералы и различные витаминоподобные вещества, в том числе кверцетин.
Читатели «ФиС» знают, что антираковые свойства гречневой каши впервые начал применять наш соотечественник доктор-онколог В.А. Ласкин. Было это более 35 лет назад. Причем особенно мощно свое действие гречневая каша стала проявлять в составе строгой диеты (гречневая каша, оливковое масло, шиповник, вода). Результаты ее применения, полученные Ласкиным, не оставляли в этом сомнений. Жена Вульфа Ласкина, тоже врач по профессии, вспоминала: «Возвращаясь вечером домой после приема, на котором был ранее больной раком, а теперь уже полностью выздоровевший (ведь многие приносили заключение онкологического учреждения, что у них нет больше онкологического заболевания), муж не мог успокоиться целый вечер и до глубокой ночи сидел над книгами, пытаясь понять, почему так мощно работает гречневая диета». Понимание пришло только в 2000 году, когда американские ученые определили, что гречневая крупа содержит 8% кверцетина, одного из самых мощных натуральных веществ для профилактики и терапии рака.
Что же касается оливкового масла, то, с моей точки зрения, доктор Ласкин несколько недооценивал роль оливкового масла в своей диете. Когда я его спросил, почему он выбрал именно оливковое масло, он ответил, что жители средиземноморского бассейна употребляют в пищу довольно много оливкового масла и мало болеют раком. Эта мысль его увлекла, но, поскольку он не знал, какие компоненты оливкового масла ответственны за антираковые эффекты, он, согласно логике советского врача, больше думал о гречневой каше с рекордным содержанием кверцетина.
А между тем в последние годы именно в оливковом масле были открыты уникальные антиоксиданты фенольной и нефенольной природы, которые не менее кверцетина важны для противодействия раку. И теперь я уверен, что эффективность диеты Ласкина связана именно с сочетанием гречневой каши и большого количества оливкового масла (6-8 ст. ложек в день).
Теперь о полезных антираковых растительных продуктах, список которых опубликован в «АиФ-Здоровье». Почти все они входят в состав «недельной диеты» доктора Ласкина. То есть сначала в течение 5-6 недель (иногда дольше) пациент соблюдает строгую диету, а затем переходит на недельную, в которую помимо гречневой каши, оливкового масла и шиповника включены черника, брокколи, грибы шитаки... Из списка продуктов, перечисленных в «АиФ-Здоровье», я бы добавил в меню Ласкина еще и клюкву, куркуму и семя льна.
Зиновий БЕЛКИН, кандидат медицинских наук
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения пероксидазы хрена включает гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, концентрирование ультрафильтрацией и осаждение белков сульфатом аммония. Осадок белков диализуют против воды и 0,01-0,03 М раствора TEA-HCl буфера, с последующей очисткой пероксидазы от балластных белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в том же буфере. Затем продолжают очистку в 0,01-0,03 М растворе МОРS-NаОН буфера на колонке с КМ-целлюлозой при значениях pH и pK буферов 7,1-7,4 и 7,5-7,6 соответственно. Очищенный целевой продукт диализуют против воды и 0,01-0,03 М NaCl, а затем лиофилизируют. Способ обеспечивает упрощение получения высокоочищенной пероксидазы хрена и повышение ее выхода. 2 з.п. ф-лы.
Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, а именно к получению высокоочищенной пероксидазы хрена адсорбционной хроматографией.
Высокоочищенная пероксидаза хрена (критерий очистки А 403 /А 275 3,1 - RZ от Reinheitszahl - показатель чистоты) - один из наиболее востребованных ферментов для биохимии и биотехнологии. В частности, она широко используется в методах иммуноферментного анализа, например, для определения ВИЧ-инфекции, гепатитов и других социально значимых заболеваний человека.
Известен способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента водой или солевым раствором, фракционирование экстракта сульфатом аммония, очистку гель-фильтрацией, спиртовым осаждением, переосаждением хлоридом аммония, фильтрацией через сефадекс G-50, ионообменной хроматографией и диализом .
Недостатками этого способа являются сложность и продолжительность получения, сравнительно низкая чистота полученного препарата (RZ~2,7), трудность получения большого количества фермента.
Известен также способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, фракционирование экстракта сульфатом аммония, гель-фильтрацию .
Недостаток этого способа заключается в низком выходе фермента, низкой его чистоте.
Задачей данного изобретения является повышение выхода высокоочищенного фермента при упрощении способа производства.
Поставленная задача решается тем, что предложен способ получения пероксидазы хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, концентрирование ультрафильтрацией, осаждение белков сульфатом аммония, диализ осадка белков против 0,01-0,03 М раствора TEA (триэтаноламин)-HCl буфера, последовательную очистку пероксидазы от балластных белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в том же буфере, а затем в 0,01-0,03 М растворе MOPS(N-морфолинопропансульфоновая кислота)-NaOH буфера на колонке с КМ-целлюлозой, при значениях pH и pK буферов, близких к изоточке целевого продукта, и концентрации, обеспечивающей движение пероксидазы вниз по колонке, по принципу адсорбции-десорбции, со скоростью, меньшей, чем у части балластных белков, имеющих одноименный заряд с зарядом на колонке, тогда как другая их часть остается на старте вследствие ионного обмена; раствор очищенного целевого продукта диализуют против воды и 0,01-0,03 М NaCl с последующей лиофилизацией, причем фермент после гомогенизации корней экстрагируют водой, сульфат аммония вносят в концентрации 70-75% от насыщения, а значения pH и pK буферов составляют 7,1-7,4 и 7,5-7,6 соответственно.
Отличием данного способа является одновременное использование одного и того же носителя для адсорбционной хроматографии целевого продукта и для очистки от балластных белков, при значениях pH, близких к изоточке целевого продукта, а также использование буферов небольшой концентрации со значениями pK, близкими к изоточке фермента, причем компоненты буферов имеют объемистые электронодонорные или электроноакцепторные группы, конкурирующие за адсорбент с группами макромолекулы пероксидазы. Пероксидазу хрена получают из сока корней хрена, собранных в самом начале цветения, в это время содержание фермента в корнях в 3-4 раза выше, по сравнению с прототипом.
Техническим результатом решения задачи является получение пероксидазы с RZ 3,35 и активностью 1000 ед/мг фермента (субстрат 4-аминоантипирин) за одну стадию. Выход фермента 3,2 г из 100 кг корней, что в 6 раз выше по сравнению с прототипом. Предложенный способ позволяет уменьшить число стадий и за счет этого снизить время на получение целевого продукта и увеличить в 1,5-2 раза его выход.
Известно, что адсорбция белков на каком-либо сорбенте связана с различными нековалентными взаимодействиями макромолекулярных групп с поверхностью этого сорбента. Однако их суммарная энергия мала по сравнению, например, со связыванием белок-ингибитор при аффинной хроматографии или ионными взаимодействиями на ионообменнике. Таким образом, адсорбционное взаимодействие маскируется другими, более сильными взаимодействиями поверхность белка-поверхность носителя. Поэтому, если предполагается очистить данный белок адсорбционной хроматографией, необходимо создать такие условия, чтобы балластные белки либо связывались на колонке, либо двигались по ней быстрее целевого белка, т.е. чтобы только данный белок мог медленно двигаться по принципу адсорбции-десорбции. Такие условия создаются, если использовать в качестве носителя для адсорбционной хроматографии целлюлозу, а для очистки от балластных белков использовать ДЭАЭ- и КМ-группы. Для того чтобы добиться одновременного движения целевого фермента по принципу адсорбционной хроматографии, а части балластных белков - вследствие отталкивания заряженного белка от одноименно заряженных групп, необходимо совместить эти группы и целлюлозный носитель, т.е. использовать ДЭАЭ- и КМ-целлюлозы. Если проводить хроматографию при значениях pH, близких к изоточке целевого фермента, часть балластных белков задерживается на старте вследствие ионного обмена, а часть быстро движется вниз из-за взаимодействия с одноименными зарядами ионообменника. Незаряженный или слабо заряженный фермент будет медленно двигаться, по сравнению с балластными белками, вниз и на ДЭАЭ- и на КМ-целлюлозах в случае конкуренции между группами фермента и компонентами буфера за сорбент.
Буфер имеет:
1) небольшую концентрацию, поскольку при ее повышении конкуренция компонентов буфера может быть столь сильной, что целевой продукт будет двигаться со скоростью, сравнимой со скоростью движения балластных белков, и очистки не произойдет;
2) поскольку буфер должен обеспечить устойчивое значение pH при небольшой концентрации, он должен иметь pK, близкое к изоточке целевого продукта;
3) компоненты буфера должны иметь объемистые группы для эффективной конкуренции с поверхностными группами целевого продукта. Балластные белки будут заряжены при этом значении pH и, в зависимости от заряда, либо остаются на старте («ионный обмен»), либо движутся значительно быстрее целевого продукта (взаимодействие одноименных зарядов). Незаряженный или слабо заряженный целевой продукт будет отделяться и от белков, остающихся на старте, и от быстро движущихся белков. Лишь белки, имеющие изоточки, близкие к изоточке пероксидазы, могли бы связываться адсорбционно и тем самым уменьшать степень очистки, но, как показывает опыт, такие белки в соке из корней хрена отсутствуют или находятся в минорном количестве.
Очистка целевого продукта:
1) белки из сока корней хрена после их гомогенизации экстрагируют водой, доводят ультрафильтрацией до начального объема сока, осаждают сульфатом аммония, диализуют против воды, а затем против 0,01-0,03 М ТЕА-HCl буфера, pH 7,1-7,4 и наносят последовательно на колонки с ДЭАЭ-целлюлозой в Cl - -форме и КМ-целлюлозой в Na + -форме, уравновешенные соответственно 0,01-0,03 М ТЕА-HCl и 0,01-0,03 М MOPS-NaOH буферами, pH 7,1-7,4 (pK буферов 7,5 и 7,6; изоточка пероксидазы 7,2);
2) за медленным движением коричневого кольца фермента следят визуально;
3) после выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,01-0,03 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,01-0,03 М NaCl и лиофилизируют;
4) измеряют значения RZ продукта и его активность по 4-аминоантипирину.
Для измерения пероксидазной активности в кювету вносят 1,5 мл фенол-аминоантипиринового раствора (810 мг фенола растворяют в 40 мл воды, добавляют 25 мг 4-аминоантипирина и разбавляют водой до 50 мл), 1,4 мл раствора пероксида водорода (1 мл 30% H 2 O 2 разбавляют водой до 100 мл; далее 1 мл этого раствора разбавляют 0,2 М калий-фосфатным буфером, pH 7,0 до 50 мл), 0,1 мл раствора фермента. Измерение оптической плотности проводят при 510 нм и температуре 25°С. Определяют скорость из линейной части кривой:
ед/мг=( А 510 /мин)/6,58×мг фермента/мл.
Концентрация фермента равна: мг фермента/мл=А 403 ×0,44.
Следующие примеры иллюстрируют эти положения.
Пример 1. 100 кг корней хрена двухлетнего возраста, собранных в начале цветения, промывают водой, гомогенизируют, экстрагируют фермент водой, концентрируют ультрафильтрацией до начального объема сока, осаждают белок сульфатом аммония (70% насыщения). Осадок растворяют в минимальном количестве воды и диализуют против нее, а затем против 0,01 М ТЕА-HCl буфера, pH 7,1. Концентрацию белка доводят до 80 мг/мл концентрированием ультрафильтрацией (определение белка по Бредфорд или Лоури) и наносят на колонку (10×20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,01 М ТЕА-HCl буфером, pH 7,1 и pK 7,5. После прохождения самотеком коричневого кольца его наносят на колонку того же объема с КМ-целлюлозой, уравновешенную 0,01 М MOPS-NaOH буфером, pH 7,1 и pK 7,5. После выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,01 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,01 М NaCl и лиофилизируют.
Пример 2. 100 кг корней хрена двухлетнего возраста, собранных в начале цветения, промывают водой, гомогенизируют, экстрагируют фермент водой, концентрируют ультрафильтрацией до начального объема сока, осаждают белок сульфатом аммония (75% насыщения). Осадок растворяют в минимальном количестве воды и диализуют против нее, а затем против 0,03 М ТЕА-HCl буфера, pH 7,4. Концентрацию белка доводят до 80 мг/мл концентрированием ультрафильтрацией и наносят на колонку (10×20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,03 М ТЕА-HCl буфером, pH 7,4, pK 7,6. Далее хроматографируют целевой продукт, как в примере 1, на КМ-целлюлозе, но в 0,03 М MOPS-NaOH буфере, pH 7,4, pK 7,6. После выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,03 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,03 М NaCl и лиофилизируют.
Выход: 3,2 г пероксидазы с RZ 3,35 и активностью 1000 ед/мг фермента по 4-аминоантипирину.
Пример 3. 15 г лиофилизированного порошка пероксидазы с RZ 0,3 суспендируют в 0,01 М TEA-HCl буфере, pH 7,1 центрифугируют (20 мин, 3000 г) и 300 мл супернатанта наносят на колонку (10×20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную тем же буфером. После прохождения самотеком коричневого кольца его наносят на колонку того же объема с КМ-целлюлозой, уравновешенную 0,01 М MOPS-NaOH буфером, pH 7,1, pK 7,5. После выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,01 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,01 М NaCl и лиофилизируют.
Пример 4. 15 г лиофилизированного порошка пероксидазы с RZ 0,3 суспендируют в 0,03 М TEA-HCl буфере, pH 7,4, центрифугируют (20 мин, 3000 г) и 300 мл супернатанта наносят на колонку (10×20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную тем же буфером. После прохождения самотеком коричневого кольца его наносят на колонку того же объема с КМ-целлюлозой, уравновешенную 0,03 М MOPS-NaOH буфером, pH 7,4, pK 7,6. После выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,03 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,03 М NaCl и лиофилизируют.
Выход составляет 1,5 г целевого продукта с RZ 3,35 и активностью 1000 ед/мг фермента по 4-аминоантипирину.
Таким образом, предлагаемый способ в сравнении с прототипом позволяет получить целевой продукт с RZ 3,35 и активностью 1000 ед/мг фермента по 4-аминоантипирину. Выход фермента составляет 3,2 г на на 100 кг корней, что превышает выход по прототипу ~ в 6 раз. Кроме того, полученный целевой продукт обладает большей чистотой по сравнению с прототипом (RZ соответственно 3,35 и 2,7). Упрощение способа выражается в сокращении биохимических стадий с четырех до одной. Этот способ позволяет также выделять высокоочищенную пероксидазу из лиофильно высушенного низкоочищенного фермента.
Источники литературы
1. Paul К.G. The Enzymes. New York, Acad. Press, 1963.
2. Патент РФ № 2130070.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения пероксидазы хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, концентрирование ультрафильтрацией, осаждение белков сульфатом аммония, диализ осадка, отличающийся тем, что осадок белков диализуют против воды и 0,01-0,03 М раствора TEA-HCl буфера с последующей очисткой пероксидазы от балластных белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в том же буфере, а затем в 0,01-0,03 М растворе MOPS-NaOH буфера на колонке с КМ-целлюлозой, при значениях pH и pK буферов, близких к изоточке целевого продукта 7,1-7,4 и 7,5-7,6 соответственно, очищенный целевой продукт диализуют против воды и 0,01-0,03 М NaCl, а затем лиофилизируют.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фермент после гомогенизации корней экстрагируют водой.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что сульфат аммония вносят в концентрации 70-75% насыщения.
Около 44,173.9 Да, представляет собой гликопротеид и имеет четыре остатка аминокислоты лизина для соединения с молекулой, которую требуется пометить.
Продукт активности пероксидазы хрена представляет собой цветное или люминесцентное соединение, подходящее для детекции и количественного анализа. HRP часто используют в составе конъюгатов для детекции определенных молекул. Например, в случае вестерн блоттинга используют конъюгаты HRP с антителами против заданных белков или молекул; в данном случае антитело обладает специфичностью к заданной мишени, а HRP образует детектируемый сигнал. . Пероксидазу хрена также используют в таких методиках, как ИФА и для иммуногистохимического анализа.
Пероксидаза хрена представляет собой идеальный фермент для многих методик, так как имеет относительно небольшой размер, относительно стабильна и более дешева, чем альтернативы - например, щелочная фосфатаза . HRP имеет бо льшее количество оборотов в единицу времени и потому обеспечивает развитие достаточно сильного сигнала за относительно небольшой период времени.
Пероксидаза хрена в свободной форме или в виде конъюгатов с другими молекулами требует наличие субстрата для визуализации. HRP окисляет субстрат в присутствии пероксида водорода , при этом образуются продукты, которые можно детектировать спектрофотометрически .
Коммерчески доступные субстраты пероксидазы хрена 3,3’,5,5’-Тетраметилбензидин (англ. TMB ) и 3,3"-Диаминобензидин (англ. DAB ) при окислении дают цветные продукты, а хемилюминесцентные вещества SuperSignal, ECL являются источниками детектируемого света при действии HRP.
Усиление хемилюминесценции (ECL)
Пероксидаза хрена катализирует окисление люминола в 3-аминофталат через серию интермедиатов . Данная реакция сопровождается свечением низкой интенсивности с длиной волны 428 нм. В присутствии некоторых веществ, возможно достичь усиления свечения до тысячи раз. Явление усиления свечения называют усилением хемилюминесценции (англ. enhanced chemiluminescence, ECL ). Наиболее эффективными усилителями являются производные фенолов, например, р-йодофенол. ECL позволяет детектировать около 0,5 пикограмма нуклеиновой кислоты при Саузерн блоттинге .
Примечания
Внешние ссылки
Wikimedia Foundation . 2010 .
Смотреть что такое "Пероксидаза хрена" в других словарях:
пероксидаза хрена - — Тематики биотехнологии EN horseradish peroxidase … Справочник технического переводчика
- [[Изображение:|px|Тиреопероксидаза chemical structure]] thyroid peroxidase Обозначения Symbol(s) TPO Entrez … Википедия
Вестерн блот анализ белков, разделенных при помощи градиентного электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS. Вестерн блоттинг (белковый иммуноблот, англ. Western blot) аналитический метод, используемый для определения… … Википедия
Вестерн блоттинг (вестерн блот, белковый иммуноблот, англ. Western blot) аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце. На первом этапе использует электрофорез белков в полиакриламидном геле для… … Википедия
- (англ. Peroxiredoxins, Prxs, КФ 1.11.1.15) широкораспространённая семья антиоксидантных ферментов. У млекопитающих ферменты этой группы контролируют уровень цитокин индуцированных пероксидов, участвующих в передаче клеточных сигналов. … … Википедия
Глутатионпероксидазы (ГП) семейство ферментов, защищающих организм от оксидативного повреждения. ГП катализируют распад липидных пероксидаз и перекиси водорода. Известно несколько генов, кодирующих разные формы глутатионпероксидаз, отличающиеся… … Википедия
Способ предусматривает размельчение и гомогенизацию пророщенных корней хрена, экстракцию гомогенизата корней хрена 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия. Отделяют балластные белки и осаждают пероксидазу солями сульфата аммония 45-48% насыщения и 85-90% насыщения соответственно. Гельфильтрацию раствора пероксидазы осуществляют на сефадексе G-100 с элюированием 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия. Хроматографическую очистку проводят на карбоксиметилцеллюлозе. Осуществляют лиофильную сушку целевой пероксидазы. Проводят диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0 и диализ против калий-фосфатного буфера с рН 8,0±0,1. Осуществляют концентрирование с дополнительной очисткой на ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией тем же буфером с последующим диализом против деионизованной воды. Способ позволяет получить пероксидазу с высокой удельной активностью и высоким выходом. Выход пероксидазы составляет 2,52-3,50 г/кг корней хрена, удельная активность - 640-700 Е.А./мг белка. 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.
Рисунки к патенту РФ 2353652
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к производству ферментов из растительного сырья, и может быть использовано для лабораторного и промышленного производства фермента пероксидазы из корней хрена для иммунологии и иммунохимии в качестве главной составной части конъюгатов для иммуноферментных анализов.
Известны различные способы получения пероксидазы из корней хрена .
Известен способ получения пероксидазы из корней хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента солевым раствором, осаждение фермента солями сульфата аммония, гельфильтрацию, спиртовое осаждение, электрофорез, переосаждение хлоридом аммония, фильтрацию через сефадекс G-50 и ДЭАЭ-целлюлозу и диализ .
Основными недостатками данного способа являются невысокая активность и чистота полученного продукта, а также сложность его получения и большое количество стадий технологического процесса.
Известен также способ получения пероксидазы из корней хрена, по которому корни хрена гомогенизируют, затем экстрагируют фермент водой и осаждают пероксидазу солями сульфата аммония с последующей гельфильтрацией [Пат. Венгрии 172872, C07G 7/022].
Недостатком данного способа является низкий выход и низкая чистота фермента.
Известен способ [А.С. Болгарии 46675, C12N 9/08, 15.02.90], по которому корни хрена проращивают в течение 2-3 суток, затем гомогенизируют и экстрагируют фермент водой в течение суток. Водный экстракт центрифугируют с последующим фракционированием белков солями сульфата аммония, затем сульфатаммонийный осадок фермента растворяют в дистиллированной воде и подвергают ультрафильтрации на фильтрах "Милипор" PTGC 000 05. К полученному фильтрату прибавляют 0,5 М фосфатный буфер (рН 8) в соотношении 100 частей буфера на 1 часть фильтрата и пропускают через колонку с ионообменником ДЭАЭ-Сефадекс А-50, затем последовательно ультрафильтруют на "Милипор" PTGC 000 05, РТНК 000 05, PTGC 000 05 и подвергают лиофильной сушке.
Недостатком данного метода является недостаточно высокий выход пероксидазы, высокая трудоемкость и длительность процесса.
Наиболее близким является способ [Пат. РФ 2130070, C12N 9/08, 10.05.1999], в котором промытые водой корни хрена зачищают на 1/3 массы в присутствии 0,25% раствора пищевой аскорбиновой кислоты, используемого в качестве экстрагирующего раствора. Пероксидазу из очисток экстрагируют в течение 1 ч 0,25% раствором аскорбиновой кислоты, затем экстракт фильтруют и центрифугируют. К надосадочной жидкости добавляют 5% сульфита натрия и выдерживают в течение 24 ч при комнатной температуре для "созревания" фермента. "Созревший" раствор фермента концентрируют на ультрафильтрационных волоконных аппаратах с фильтрами, имеющими диаметр пор менее 40 кДа. К сконцентрированному в 10 раз раствору добавляют сульфат аммония до конечного насыщения 85-90%, центрифугируют, осадок растворяют в десятикратном объеме бидистиллированной воды и наносят на колонку, заполненную сефадексом G-25, элюцию проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, содержащие пероксидазу с величиной R Z >0,1. К собранным фракциям добавляют сульфат аммония до насыщения 85-90%, центрифугируют, осадок растворяют в 3-кратном по объему количестве бидистиллированной воды и наносят на колонку для гельфильтрации, заполненную сефадексом G-50, элюцию проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, содержащие пероксидазу, с величиной R Z >0,5. Фракции смешивают, дотитровывают до рН 4,4 и подвергают очистке на карбоксиметилцеллюлозе, фермент элюируют в градиенте концентраций от 5 мМ до 0,15 М ацетатного буфера (рН 4,4) (V=S-500 мл, R-500 мл). Собирают фракции с величиной R Z >2,7 и с концентрацией фермента не менее 10 мг/мл. Фракции объединяют, дотитровывают до рН 5,0 и лиофильно высушивают.
Недостатками данного метода являются недостаточно высокая чистота и активность и небольшие выходы пероксидазы.
Изобретение решает задачу создания промышленного способа получения пероксидазы из корней хрена, позволяющего получать пероксидазу с высокой чистотой, с высокой удельной активностью и с высоким выходом.
Поставленная задача решается способом получения фермента пероксидазы из корней хрена, который включает размельчение и гомогенизацию пророщенных корней хрена, экстракцию гомогенизата корней хрена, отделение балластных белков и осаждение пероксидазы солями сульфата аммония, гельфильтрацию раствора пероксидазы на сефадексе, хроматографическую очистку на карбоксиметилцеллюлозе, лиофильную сушку целевой пероксидазы, при этом измельченные корни хрена экстрагируют 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия с рН=4,4±0,2; гельфильтрацию раствора пероксидазы осуществляют на сефадексе G-100 с элюированием 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия с рН 4,4-5,0, проводят диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0 и диализ против калий-фосфатного буфера с рН 8,0±0,1 и концентрирование с дополнительной очисткой на ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией тем же буфером с последующим диализом против деионизованной воды.
Дважды используют осаждение белков солями сульфата аммония: для отделения балластных белков используют 45-48% насыщение, а для осаждения пероксидазы используют 85-90% насыщение,
Хроматографической очистке пероксидазы на карбоксиметилцеллюлозе предшествует диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0.
Лиофильной сушке предшествует диализ раствора пероксидазы против деионизованной воды.
На Фиг.1 приведена принципиальная схема выделения пероксидазы из корней хрена.
Корни хрена отмывают под проточной водой и проращивают в течение 140-160 ч при температуре +25±1°С. Пророщенные корни измельчают и экстрагируют 0,15 М раствором хлорида натрия в течение 12±2 ч при постоянном перемешивании, затем центрифугируют.
К супернатанту-1 (Фиг.1) при непрерывном перемешивании добавляют 16,7±0,05 кг (45-48% насыщения) сульфата аммония, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, а к образовавшемуся супернатанту-2 (Фиг.1) добавляют еще 11,8±0,05 кг (85% насыщения) сульфата аммония, осадок (Фиг.1) отделяют центрифугированием и растворяют дистиллированной водой до конечного объема 200±10 мл. После центрифугирования супернатант, содержащий пероксидазу, наносят на колонку, заполненную сефадексом G-100, и элюируют 0,15 М раствором хлорида натрия со скоростью 100 мл/ч, в ходе элюции отбирают фракции по 20 мл. В собранных фракциях измеряют R Z =D 408 /D 275 . Фракции, в которых R Z не менее 0,8, объединяют и диализуют против натрий-ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (буфер-1), затем обессоленный раствор пероксидазы наслаивают на колонку, заполненную карбоксиметилцеллюлозой и уравновешенную буфером-1, и элюируют линейным градиентом 5 мМ - 0,1 М ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (V=S-0,5 л, R-0,5 л). В белковых фракциях измеряют величину R Z . Фракции, в которых значение R Z не менее 2,5, объединяют и диализуют против калий-фосфатного буфера (рН 8,0±0,1) (буфер-2), отдиализованный раствор фермента наслаивают на колонку, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой, и элюируют буфером-2. Фракции, в которых значение R Z не менее 3,0, объединяют и диализуют против деионизованной воды, затем переносят в стерильную термостойкую колбу, замораживают жидким азотом и лиофильно сушат до полного высыхания препарата.
Существенными отличительными признаками предлагаемого способа получения биологически активных веществ являются:
Использование гельфильтрации на сефадексе G-100 для максимально полной очистки пероксидазы от низкомолекулярных примесей;
Диализ против натрий-ацетатного буфера (рН 4,4-5,0), позволяющий обессолить раствор пероксидазы и подготовить его к хроматографии на карбоксиметилцеллюлозе;
Диализ против калий-фосфатного буфера (рН 8,0±0,1), позволяющий перевести раствор пероксидазы в оптимальный буфер с оптимальным рН для нанесения на ДЭАЭ-целлюлозу;
Ионообменная хроматография пероксидазы на ДЭАЭ-целлюлозе как прием, обеспечивающий не только дополнительную очистку, но и концентрирование раствора фермента.
Таким образом, нами предлагается новый подход, позволяющий осуществлять переработку корней хрена с получением фермента пероксидазы высокой чистоты и удельной активности.
Отличие заявляемого способа от ближайшего аналога и прототипа состоит в следующем.
В заявляемом способе измельченные корни хрена экстрагируют 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия с рН=4,4±0,2, тем самым достигается максимально полный переход фермента в раствор, и при этом фермент не теряет своей активности.
В аналоге изобретения [Пат. РФ 2130070, C12N 9/08, 10.05.1999] пероксидазу из очисток (без гомогенизации!) экстрагируют в течение 1 ч 0,25% раствором пищевой аскорбиновой кислоты, что может сказываться на выходе пероксидазы, поскольку очистки не гомогенизируются, а следовательно, фермент переходит в раствор далеко не полностью, при этом экстракция протекает в кислых условиях, что может привести к частичной инактивации фермента. В прототипе изобретения [А.С. Болгарии 46675, C12N 9/08, 15.02.90] фермент из гомогенизата корней хрена экстрагируют водой, что также приводит к низкому выходу пероксидазы из гомогенизата в раствор.
В отличие от аналога изобретения, где пероксидазу осаждают дважды 85-90% насыщением сульфатом аммония, и прототипа изобретения, где четыре раза проводят осаждение белков солями сульфата аммония, в заявляемом способе проводят отделение балластных белков 45-48% насыщением, а затем осаждают пероксидазу 85% насыщением.
В аналоге и прототипе изобретения концентрирование проводят методом ультрафильтрации, при этом в аналоге изобретения ультрафильтрация предшествует сульфатаммонийному осаждению пероксидазы, что приводит к большой вероятности соосаждения примесных белков, а соответственно, к более низкой чистоте конечного продукта. В заявляемом способе пероксидаза подвергается концентрированию на ионообменном сорбенте ДЭАЭ-целлюлоза на заключительной стадии технологического процесса, что приводит и к дополнительной очистке фермента.
В заявляемом способе гельфильтрацию проводят на сефадексе G-100 с элюированием 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия (рН 4,4-5,0), что позволяет полностью избавиться от зеленоватого оттенка раствора пероксидазы, обусловленного наличием хлорофилла и родственных соединений, и веществ с меньшим, чем у пероксидазы, размером молекул. В аналоге изобретения гельфильтрацию проводят на сефадексе G-25, который по способности задерживать примесные частицы, учитывая размер молекулы пероксидазы (около 40 кДа), уступает сефадексу G-100.
Сущность изобретения иллюстрируется следующим примерами.
Пример 1. Получение грубого экстракта
50 кг корней хрена отмывают под проточной водой и проращивают в течение 140-160 ч при температуре +25±1°С. Пророщеные корни измельчают на лопастном гомогенизаторе и заливают 50 л 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия (рН 4,4±0,2). Суспензию экстрагируют в течение 12±2 ч при постоянном перемешивании, затем центрифугируют.
К супернатанту-1 объемом 60 л для отделения балластных белков при непрерывном перемешивании добавляют сульфат аммония до 45-48% насыщения. (Под 100%-ным насыщением имеется в виду количество соли, при добавлении которого раствор становится насыщенным, а при дальнейшем добавлении соли раствор становится пересыщенным, и соль выпадает в осадок. Для растворов с сульфатом аммония 100% насыщением является добавление и полное растворение 70,7 г сульфата аммония в 100 мл дистиллированной воды.) Осадок-1 отделяют центрифугированием. Далее образовавшийся супернатант-2 объемом 55 л для осаждения пероксидазы насыщают сульфатом аммония до 85%, осадок-2 отделяют центрифугированием. Образовавшийся осадок-2 растворяют деионизованной водой до конечного объема 200±10 мл, нерастворившийся осадок-3 отделяют центрифугированием.
Гель-хроматография на сефадексе G-100.
Раствор пероксидазы наносят на колонку объемом 1 л, заполненную сефадексом G-100. Элюцию ведут 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия (рН 4,4-5,0) со скоростью 100 мл/ч, в ходе элюции отбирают фракции по 20 мл. В собранных фракциях измеряют R Z =D 408 /D 275 . Фракции, в которых R Z не менее 0,8, объединяют.
В сборник помещают 5 л 5±0,1 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,4-5,0) (буфер-1) и диализный мешок с объединенными фракциями пероксидазы. Диализ ведут при постоянном перемешивании в течение 24 ч, трижды меняя буфер в сборнике.
Обессоленный раствор фермента наслаивают на колонку объемом 1 л, заполненную карбоксиметилцеллюлозой и уравновешенную буфером-1. Элюцию ведут со скоростью 50 мл/ч в линейном градиенте 5 мМ-0,1 М ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (V=S-0,5 л, R-0,5 л). В белковых фракциях измеряют величину R Z . Фракции, в которых значение R Z не менее 2,5, объединяют.
В сборник помещают 5 л 20±0,1 мМ калий-фосфатного буфера (рН 8,0±0,1) (буфер-2) и диализный мешок с объединенными фракциями фермента. Диализ ведут аналогично.
Концентрирующая хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе.
Раствор фермента с рН 8,0±0,1 наслаивают на колонку объемом 300 мл, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию ведут буфером-2 со скоростью 50 мл/ч. Фракции, в которых значение R Z не менее 3,0, объединяют.
В сборник помещают 5 л деионизованной воды и диализный мешок с раствором пероксидазы. Диализ ведут аналогично.
Лиофильная сушка.
Раствор пероксидазы переносят в стерильную термостойкую колбу, замораживают жидким азотом и лиофильно сушат до полного высыхания препарата.
Пример 2 (сравнительный)
В данном примере выдержаны условия получения пероксидазы по прототипу, но для улучшения основных показателей пероксидазы изменены две существующие в прототипе стадии, а именно: для ультрафильтрационного концентрирования раствора пероксидазы используют два типа колонок с полыми волокнами, в отличие от прототипа, где используют один тип волокон, и дробное фракционирование белков солями сульфата аммония (как в заявляемом способе).
Получение грубого экстракта.
50 кг корней хрена отмывают под проточной водой и зачищают на 1/3 часть массы в присутствии 33,5 л 0,25% раствора пищевой аскорбиновой кислоты, в котором полученные очистки выдерживают в течение 1 ч для экстракции фермента пероксидазы. Далее экстракт центрифугируют на проточной центрифуге и выдерживают в течение 24 ч для "созревания" фермента.
Первичная очистка и концентрирование.
В полученный экстракт добавляют 1,7 кг (5% по весу) сульфита натрия и экстракт подвергают концентрированию и первичной очистке методом ультрафильтрации на установке с полыми полимерными волокнами УПВ-6, укомплектованной колонками с фильтрами, имеющими размеры пор 60 кДа и 5 кДа. Принципиальная схема установки представлена на Фиг.2, где показаны центробежный насос 1; предфильтр 2; колонка с волокнами, имеющими размер пор 60 кДа 3; колонка с волокнами, имеющими размер пор 5 кДа 4; фильтрат пероксидазы 5; концентрированный раствор пероксидазы 6; фильтрат, содержащий низкомолекулярные белки 7.
Фракционирование белков солями сульфата аммония.
К концентрату объемом 6 л для отделения балластных белков при непрерывном перемешивании добавляют сульфат аммония до 45-48% насыщения. Осадок отделяют центрифугированием. Далее образовавшийся супернатант объемом 5,7 л для осаждения пероксидазы насыщают сульфатом аммония до 85%, осадок отделяют центрифугированием, который растворяют бидистиллированной водой до конечного объема 200±10 мл, нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием.
Гель-хроматография на сефадексе G-25 и G-50.
Дальнейшую очистку пероксидазы проводят на колонке для гельфильтрации, заполненной сефадексом G-25 и уравновешенной бидистиллированной водой. Раствор пероксидазы наносят на колонку, элюирование проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, в которых R Z не менее 0,2. К собранным фракциям добавляют сульфат аммония до 90% насыщения, перемешивают до полного растворения соли и центрифугируют. Осадок растворяют в 3-кратном по объему количестве бидистиллированной воды и наносят на колонку для гельфильтрации, заполненную сефадексом G-50 и уравновешенную бидистиллированной водой. Элюирование проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, в которых R Z не менее 0,6. С помощью 50% уксусной кислоты значение рН во фракциях с пероксидазой устанавливают на уровне 4,4.
Хроматография на карбоксиметилцеллюлозе.
Фракции пероксидазы наслаивают на колонку объемом 1 л, заполненную карбоксиметилцеллюлозой, предварительно уравновешенную 5 мМ ацетатным буфером с рН 4,4. Элюирование проводят линейным градиентом 5 мМ-0,15 М ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (V=S-0,5 л, R-0,5 л) в течение 1 часа. В белковых фракциях измеряют величину R Z . Фракции, в которых значение R Z не менее 2,7, объединяют, устанавливают рН 5,0 добавлением аммиака и лиофильно высушивают.
Сравнительные данные по примеру 1 и 2 приведены в таблице.
Таблица Сравнительные данные основных параметров качества пероксидазы из корней хрена при использовании двух способов получения. |
||
Наименование технологического параметра, единицы измерения. | Пример 1 (заявляемый способ) | Пример 2 (известный способ) |
Выход по массе пероксидазы, г/кг корней хрена. | 2,52-3,50 | 0,21-0,85 |
Удельная активность препарата, Е.А./мг белка* | 640-700 | 560-610 |
Чистота по спектрофотометру R Z =D 408 /D 275 | 3,00-3,20 | 2,70-3,00 |
* - Удельная активность вычислялась с использованием данных, приведенных в работе СТП 103.34-83. Правила вычисления и обработки результатов количественного анализа. НИКТИ БАВ, 1983. |
Таким образом, как видно из примеров и таблицы, заявляемый способ получения пероксидазы из корней хрена (пример 1) позволяет получать пероксидазу с высокими выходами, с чистотой и активностью, достаточной для использования данного фермента в качестве составной части конъюгатов для иммуноферментных анализов. А в условиях прототипа (пример 2) даже при усовершенствовании двух стадий, улучшающих показатели, выход, удельная активность и чистота целевой пероксидазы ниже аналогичных показателей заявляемого способа.
Данный способ может быть использован в промышленном получении пероксидазы из корней хрена.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения фермента пероксидазы из корней хрена, включающий размельчение и гомогенизацию пророщенных корней хрена, экстракцию гомогенизата корней хрена, отделение балластных белков и осаждение пероксидазы солями сульфата аммония, гельфильтрацию раствора пероксидазы на сефадексе, хроматографическую очистку на карбоксиметилцеллюлозе, лиофильную сушку целевой пероксидазы, отличающийся тем, что измельченные корни хрена экстрагируют 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия; гельфильтрацию раствора пероксидазы осуществляют на сефадексе G-100, проводят диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0 и диализ против калий-фосфатного буфера с рН 8,0±0,1, и концентрирование с дополнительной очисткой на ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией тем же буфером с последующим диализом против деионизованной воды.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что измельченные корни хрена экстрагируют 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия с рН 4,4±0,2.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что дважды используют осаждение белков солями сульфата аммония: для отделения балластных белков используют 45-48% насыщение, а для осаждения пероксидазы используют 85-90% насыщение.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что гельфильтрацию проводят на сефадексе G-100 с элюированием 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия с рН 4,4-5,0.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографической очистке пероксидазы на карбоксиметилцеллюлозе предшествует диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что лиофильной сушке предшествует диализ раствора пероксидазы против деионизованной воды.
Коммерчески доступные субстраты пероксидазы хрена 3,3’,5,5’-Тетраметилбензидин (англ. TMB ) и 3,3"-Диаминобензидин (англ. DAB ) при окислении дают цветные продукты, а хемилюминесцентные вещества SuperSignal, ECL являются источниками детектируемого света при действии HRP.
Усиление хемилюминесценции (ECL)
Пероксидаза хрена катализирует окисление люминола в 3-аминофталат через серию интермедиатов . Данная реакция сопровождается свечением низкой интенсивности с длиной волны 428 нм. В присутствии некоторых веществ, возможно достичь усиления свечения до тысячи раз. Явление усиления свечения называют усилением хемилюминесценции (англ. enhanced chemiluminescence, ECL ). Наиболее эффективными усилителями являются производные фенолов, например, п-йодфенол. ECL позволяет детектировать около 0,5 пикограмма нуклеиновой кислоты при Саузерн блоттинге .
Напишите отзыв о статье "Пероксидаза хрена"
Примечания
Внешние ссылки
- MeSH Horseradish+peroxidase
Отрывок, характеризующий Пероксидаза хрена
Посидев несколько времени и дотронувшись, сам не зная для чего, рукой до шероховатости блика портрета, он встал и опять позвал Боссе и дежурного. Он приказал вынести портрет перед палатку, с тем, чтобы не лишить старую гвардию, стоявшую около его палатки, счастья видеть римского короля, сына и наследника их обожаемого государя.Как он и ожидал, в то время как он завтракал с господином Боссе, удостоившимся этой чести, перед палаткой слышались восторженные клики сбежавшихся к портрету офицеров и солдат старой гвардии.
– Vive l"Empereur! Vive le Roi de Rome! Vive l"Empereur! [Да здравствует император! Да здравствует римский король!] – слышались восторженные голоса.
После завтрака Наполеон, в присутствии Боссе, продиктовал свой приказ по армии.
– Courte et energique! [Короткий и энергический!] – проговорил Наполеон, когда он прочел сам сразу без поправок написанную прокламацию. В приказе было:
«Воины! Вот сражение, которого вы столько желали. Победа зависит от вас. Она необходима для нас; она доставит нам все нужное: удобные квартиры и скорое возвращение в отечество. Действуйте так, как вы действовали при Аустерлице, Фридланде, Витебске и Смоленске. Пусть позднейшее потомство с гордостью вспомнит о ваших подвигах в сей день. Да скажут о каждом из вас: он был в великой битве под Москвою!»
– De la Moskowa! [Под Москвою!] – повторил Наполеон, и, пригласив к своей прогулке господина Боссе, любившего путешествовать, он вышел из палатки к оседланным лошадям.
– Votre Majeste a trop de bonte, [Вы слишком добры, ваше величество,] – сказал Боссе на приглашение сопутствовать императору: ему хотелось спать и он не умел и боялся ездить верхом.
Но Наполеон кивнул головой путешественнику, и Боссе должен был ехать. Когда Наполеон вышел из палатки, крики гвардейцев пред портретом его сына еще более усилились. Наполеон нахмурился.
– Снимите его, – сказал он, грациозно величественным жестом указывая на портрет. – Ему еще рано видеть поле сражения.
Боссе, закрыв глаза и склонив голову, глубоко вздохнул, этим жестом показывая, как он умел ценить и понимать слова императора.
Весь этот день 25 августа, как говорят его историки, Наполеон провел на коне, осматривая местность, обсуживая планы, представляемые ему его маршалами, и отдавая лично приказания своим генералам.
Первоначальная линия расположения русских войск по Ко лоче была переломлена, и часть этой линии, именно левый фланг русских, вследствие взятия Шевардинского редута 24 го числа, была отнесена назад. Эта часть линии была не укреплена, не защищена более рекою, и перед нею одною было более открытое и ровное место. Очевидно было для всякого военного и невоенного, что эту часть линии и должно было атаковать французам. Казалось, что для этого не нужно было много соображений, не нужно было такой заботливости и хлопотливости императора и его маршалов и вовсе не нужно той особенной высшей способности, называемой гениальностью, которую так любят приписывать Наполеону; но историки, впоследствии описывавшие это событие, и люди, тогда окружавшие Наполеона, и он сам думали иначе.
Наполеон ездил по полю, глубокомысленно вглядывался в местность, сам с собой одобрительно или недоверчиво качал головой и, не сообщая окружавшим его генералам того глубокомысленного хода, который руководил его решеньями, передавал им только окончательные выводы в форме приказаний. Выслушав предложение Даву, называемого герцогом Экмюльским, о том, чтобы обойти левый фланг русских, Наполеон сказал, что этого не нужно делать, не объясняя, почему это было не нужно. На предложение же генерала Компана (который должен был атаковать флеши), провести свою дивизию лесом, Наполеон изъявил свое согласие, несмотря на то, что так называемый герцог Эльхингенский, то есть Ней, позволил себе заметить, что движение по лесу опасно и может расстроить дивизию.